Автори: Aloysius Adibe, Margaret Crumlish, Jimmy Turnbull and Simon MacKenzie
Вступ
Африканський сом Clarias gariepinus є домінуючим видом аквакультури в Нігерії з обсягом виробництва понад 160000 тонн на рік (Dauda et al., 2018) та 2 мільйонами тонн у світі (FAO, 2022). Його також інтенсивно вирощують у Гані, Камеруні, Кенії, Малі, Південній Африці, Бразилії, Нідерландах, Угорщині, Італії та Сирійській Арабській Республіці (FAO, 2022). Спалахи захворювань, спричинених патогенними бактеріями, завдають величезних економічних збитків усім виробничим системам, в яких грамнегативна бактерія Aeromonas hydrophila є збудником спалахів рухливої аеромонадної септицемії (МАС) у сомів роду Clarias (Jiang et al., 2016). Дуже мало відомо про взаємодію хазяїн-патоген у видів роду Clarias. Метою цього дослідження було виявлення мРНК, що беруть участь у розпізнаванні патогенів та відповіді на них у C. gariepinus, для отримання нових знань, що сприятимуть розробці інноваційних стратегій боротьби з хворобами.
Матеріали та методи
Дослідження було схвалено Комісією з етики захисту тварин при Університеті Стірлінга. Сомики Clarias були отримані з популяції, вирощеної в Інституті аквакультури Університету Стірлінга (UOS – University of Stirling – Institute of Aquaculture), і утримувалися в 300-літровому резервуарі в системі рециркуляції з циклом «світло:темрява» 12:12 і температурою води 28 ± 2 °C. Всіх риб годували двічі на день комерційними гранулами з розрахунку 2% від маси тіла на добу. Параметри якості води, включаючи температуру, розчинений кисень, аміак, нітрати та рН, реєстрували щодня. Для експерименту було використано 18 риб. З кожної групи було відібрано по 3 зразки риб (TG1 = вакциновані та TG2 = невакциновані/контрольна група риб) через 24 години, 72 години та 41 день після вакцинації. Риб вакцинували шляхом внутрішньочеревної ін’єкції, використовуючи суцільноклітинний, інактивований (термічно вбитий) препарат Aeromonas hydrophila, змішаний у співвідношенні 3:7 з комерційним ад’ювантом Montanide. Кров, головну (передню) нирку, селезінку, печінку та зябра асептично видаляли у C. gariepinus та переносили у пробірки об’ємом 1,5 мл з буфером для збереження РНК.
Сім імунних генів були відібрані на основі їхніх функцій у розпізнаванні патогенів (нуклеотид-зв’язуюча олігомеризація (NOD1 і NOD2), толл-подібний рецептор 3 (TLR3), сприйнятті та інтеграції патогенів (головний комплекс гістосумісності (MHC2)) та запальній відповіді (інтерлейкін 1β, циклооксигеназа-2 (ЦОГ2) і мієлопероксидаза (МПО)). Передбачувані послідовності генів різних видів тварин (рис. 1) були знайдені за допомогою нуклеотидного запиту на сайті https://www.ncbi.nlm.nih.gov та вирівняні за допомогою програмного забезпечення MEGA-X 10.1.8. Набори праймерів для кожного гена були сконструйовані з консервативних ділянок вирівняних послідовностей за допомогою https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ tools/primer-blast/ та придбані у комерційної компанії. Загальну рибонуклеїнову кислоту (РНК) екстрагували з 100 мг тканин нирок і селезінки голови за допомогою TRI Reagent® (Sigma-Aldrich T9424) відповідно до протоколу виробника. Виділені продукти РНК перевіряли на чистоту та кількісно визначали за допомогою електрофотометра (Thermo Scientific Nanodrop 2000c), а цілісність тестували за допомогою електрофорезу в 1% агарозному гелі. З 1 мкл РНК з кожного зразка тканини створювали пул РНК і синтезували першу ланцюгову ДНК за допомогою набору для зворотної транскрипції QuantiTect® відповідно до протоколу від виробника. ПЛР для всіх мРНК оптимізували за допомогою суміші MyTaq™, використовуючи опис виробника, при градієнті температур 51-65 °С і перевіряли цілісність на електрофорезі в 1% агарозному гелі. Оптимізовані гени були успішно клоновані з використанням Nucleospin Gel та набору для очищення ПЛР (Fisher Scientific 1507/001), як описано виробником, а виділена плазмідна ДНК була секвенована комерційною компанією. Отримані послідовності були підтверджені на сайті https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM. Гени були валідовані за допомогою інструменту вирівнювання множинних послідовностей Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) шляхом вирівнювання послідовностей з відповідними наборами праймерів.
Результати та обговорення
Успішно сконструйовано та оптимізовано сім пар праймерів, специфічних до послідовностей (табл. 1). Всі праймери (за винятком IL1β) були розроблені, оптимізовані та валідовані вперше для C. gariepinus. В подальшому валідовані послідовності мРНК-мішеней будуть використані для оцінки їх розподілу та експресії в тканинах риб за допомогою qPCR в реальному часі. Вони також будуть використані для визначення схем розпізнавання патогенів рибами шляхом порівняння результатів у вакцинованих та невакцинованих групах.
Посилання
Dauda, A. B, Natrah, I., Karim, M., Kamarudin, M. S, Bichi, A. H. 2018. African Catfish Aquaculture in Malaysia and Nigeria: Status, Trends and Prospects. Fish Aqua J 9 (1): 237.
Food and Agriculture Organisation. 2022. Clarias gariepinus. Cultured Aquatic Species Information Programme. Text by Pouomogne, V. Fisheries and Aquaculture Division Rome.https://www.fao.org/ fishery/en/culturedspecies/clarias_gariepinus/en. Accessed 07/08/2023.
Jiang, X., Zhang, C., Zhao, Y., Kong X., Pei C., Li, L., Nie G. and Li, X (2016). Immune effects of the vaccine of live attenuated Aeromonas hydrophila screened by rifampicin on common carp (Cyprinus carpio L). Vaccine 34: 3087– 3092.
