БІОАКТИВНІСТЬ БОРОШНА З ЛИЧИНОК ЧОРНОЇ ЛЬВИНКИ

Автори: Artur Rombenso, Anca Rusu, Andrew Porter, Nicholas Bourne, Ha Truong, Cedric Simon, Simone Osborne

Стаття від: 3 січня 2023 року

Визначення in vitro протизапальної та імуногенної здатності

Автори використовували клітинні аналізи in vitro, щоб порівняти імуногенну та протизапальну здатність цільного та віджатого органічного борошна з  чорної львинки з рибним борошном, порошком цвіркуна та кверцетином (протизапальний засіб рослинного походження). На фото 14-денні личинки

Використання борошна з комах, в основному отриманого з личинок чорної львинки (BSF, Hermetia illucens ) як інгредієнту корму для гідробіонтів  знаходиться на стадії вивчення, але все частіше використовується в промисловості кормів для гідробіонтів.

 Більшість досліджень зосереджено на потенціалі борошна з комах як альтернативного білкового інгредієнта для кількох видів риб, включаючи райдужну форель, лосося, коропа, лаврака та сома, тоді як лише кілька досліджень досліджували імунологічні переваги борошна з комах.

Тут ми представляємо результати проекту, спрямованого на дослідження in vitro імуногенної (або прозапальної) та протизапальної здатності органічного борошна BSF з чорної львинки порівняно з іншими комерційно доступними інгредієнтами.

Налаштування дослідження

Інгредієнти

Опис інгредієнтів, досліджених протягом цього проекту, включено до таблиці 1. Усі зразки розчиняли у воді, змішували при кімнатній температурі протягом однієї години та центрифугували, щоб відокремити розчинну (надосадову) рідину від нерозчинних (гранул) матеріалу. Надосадова рідина, що містить розчинні компоненти, фільтрували через 0,22 мкм і зберігали при  -20°C до тих пір, поки не знадобилися для клітинного аналізу.

Клітинний аналіз

Клітинну лінію макрофагів миші RAW264.7 вирощували in vitro для отримання оксиду азоту (NO), сигнальної молекули, яка відіграє важливу роль у патогенезі запалення. Стимуляція продукції NO означає імуногенну або прозапальну реакцію, тоді як зниження продукції NO свідчить про протизапальну активність. Клітини макрофагів миші RAW264.7 вирощували для отримання двох різних клітинних аналізів.

Імуногенна (прозапальна) здатність in vitro

Переробка личинок чорної львинки на борошно

Щоб стимулювати вироблення NO і спостерігати будь-які імуногенні (або прозапальні) відповіді, клітини обробляли бактеріальним ліпополісахаридом (LPS) або досліджуваними інгредієнтами. Щоб переконатися, що будь-який ефект лікування не був пов’язаний з токсичністю (що може призвести до помилкових результатів), життєздатність клітин була виміряна в аналізі у відповідь на всі зразки проекту та становила від 106–124% (виражена у відсотках порівняно з необробленими клітинами) .

Була дотримана наступна методологія:

• 7 клітин культивували в колбах і підтримували при 37^оС з 5% СО₂ у ростовому середовищі (DMEM, 10% ембріональної бичачої сироватки).
• Клітини культивували приблизно до 90% змішуваності, а потім збирали та підраховували.
• 6×10⁵7 клітин/мл поміщали в прозорі 96-лункові ємності і культивували протягом двох днів у присутності водних екстрактів, приготованих із досліджуваних зразків (див. таблицю 1), розведених у середовищі для росту.
• Через два дні середовище для культивування клітин переносили в чорні 96-лункові ємкості для виробництва нітриту (тобто виявлення оксиду азоту) за допомогою DAN (2,3-діамінонафталін).
• Через 10 хвилин виміряли флуоресценцію (Ex 360 нм; Em 430 нм) і нанесли графік на стандартну криву нітриту.
• Результати були додатково екстрапольовані за допомогою стандартної кривої вироблення LPS-нітриту.
• Клітини, що залишилися в прозорих ємностях, промивали перед вимірюванням життєздатності клітин при 490 нм за допомогою аналізу проліферації клітин у водному розчині CellTiter96 (Promega).

Протизапальна здатність in vitro

У цьому дослідженні клітини одночасно обробляли LPS (для стимулювання виробництва NO) і тестовим зразком, щоб визначити, чи можуть будь-які зразки стримувати виробництво NO відповідно до протизапальної активності. Протизапальну активність порівнювали з дією чистого кверцетину, фітостеролу рослинного походження та відомої протизапальної сполуки. Знову ж таки, щоб гарантувати, що будь-який ефект лікування не був пов’язаний з інтоксикацією, життєздатність клітин була виміряна в аналізі у відповідь на всі зразки проекту та становила 70–85% (виражена у відсотках порівняно з необробленими клітинами).

Дотримувалися наступного методу:

• 7 клітин культивували в колбах і зберігали при 37°С з 5% СO₂ у поживному середовищі (DMEM, 10 % ембріональної бичачої сироватки).
• Клітини культивували приблизно до 90 % конфлюентності (змішуваності), а потім збирали та підраховували.
• 6 × 10⁵7 клітин/мл поміщали в прозорі 96-лункові ємкості і культивували протягом 2 днів у присутності водних екстрактів, отриманих із проектних зразків (див. таблицю 1), і LPS, розведених у ростовому середовищі.
• Через два дні середовище для культивування переносили в чорні 96-лункові ємності для виробництва нітриту (тобто виявлення оксиду азоту) за допомогою DAN (2,3-діамінонафталін).
• Через 10 хвилин виміряли флуоресценцію (Ex 360 нм; Em 430 нм) і нанесли графік на стандартну криву нітриту.
• Результати додатково екстраполювали за допомогою стандартної кривої продукування LPS-нітриту та порівнювали з відповіддю на дозу кверцетину.
• Клітини, що залишилися в прозорих ємностях, промивали перед вимірюванням життєздатності клітин при 490 нм за допомогою аналізу проліферації клітин у водному розчині CellTiter96 (Promega).

Статистичний аналіз

Результати аналізували на значні відмінності за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) з наступним тестом множинного порівняння Тьюкі(Tukey) або Даннетта (Dunnett). Перед аналізом припущення дисперсійного аналізу щодо нормальності залишків і однорідності дисперсій були перевірені за допомогою тестів Шапіро-Вілка та Левена відповідно. Відмінності вважалися достовірними, коли P<0,05. Усі статистичні аналізи проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism 9.

Хімічний склад досліджуваних інгредієнтів

Личинки чорної львинки та отримане борошно

Усі тестові інгредієнти корму для гідробіонтів, за винятком комерційного порошку цвіркуна, були проаналізовані співробітниками CSIRO за допомогою встановлених методів найкращої практики в аналітичній лабораторії Queensland Bioscience Precinct. Склад порошку цвіркуна  був наданий постачальником. Аналізи ґрунтувалися на Асоціації офіційних сільськогосподарських хіміків (AOAC, 2016).

Вміст сухої речовини визначали гравіметричним аналізом після сушіння при 105°C протягом 16 годин. Зольність визначали на основі зміни маси після спалювання в муфельній печі (1521CAF Ashing Furnace, SEM Equipment, Австралія) при 550°C протягом 16 годин. Сумарну частину ліпідів екстрагували методом, запропонованим Folch et al. (1957), що використовується для визначення вмісту ліпідів. Вимірювання загального вмісту азоту (N) проводили за допомогою аналізатора органічних елементів CHNS/O (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Массачусетс, США) і використовували для розрахунку вмісту сирого протеїну в зразку на основі N x 6,25. Вміст вуглеводів розраховували за різницею. Хімічний склад різних зразків наведено в таблиці 2.

Результати і обговорення

Виходячи з результатів цього дослідження in vitro, личинки BSF містять імуногенні молекули, здатні модулювати імунітет in vivo , і протизапальні молекули, які можуть полегшити запальні реакції in vivo. Результати цього проекту показують, що органічні продукти BSF можна використовувати як функціональну кормову добавку для кормів гідробіонтів , і що вдосконалення хімічного складу органічних продуктів BSF може підвищити їх цінність як альтернативного джерела білка, залежно від цільових видів аквакультури.

Імуногенна (або прозапальна) здатність in vitro

Імуногенна (або прозапальна) здатність (виражена як нанограмів LPS еквівалентів на грам вихідного матеріалу) показана на рис. 1 і була значно вищою у зразках BSF до та після в порівнянні з іншими тестовими інгредієнтами. Крім того, BSF Post продемонстрував  значно вищу імуногенну здатність порівняно з BSF Pre.

Рис. 1: Імуногенна (або прозапальна) здатність in vitro в клітинах RAW264.7 (виражена як ліпополісахаридні еквіваленти в одному грамі вихідного матеріалу).

*Позначає значні відмінності порівняно з порошком для цвіркунів  з використанням одностороннього дисперсійного аналізу з наступним тестом множинного порівняння Тьюкі.

Нещодавні дослідження in vivo досліджували імуногенну здатність додавання в корм тваринам личинок BSF (посилання доступні у відповідного автора) і спостерігали позитивний вплив на ріст, здоров’я кишечника та імунну відповідь. Останні дослідження in vitro також досліджували імуногенну здатність личинок BSF. Наприклад, Алі та його співробітники досліджували виробництво NO клітинами RAW264.7 у відповідь на екстракти личинок BSF і новий біологічно активний полісахарид (названий діптероза-BSF), очищений з екстрактів личинок BSF. Dipterose-BSF навіть стимулював виробництво NO, подібно до LPS. Таким чином, ці опубліковані висновки підтверджують результати цього дослідження та припускають, що страви або екстракти, приготовані з личинок BSF, можуть покращити здоров’я тварин завдяки імуномодуляції, якщо їх включити в раціон.

У цьому дослідженні BSF Pre і BSF Post продемонстрували вищу імуногенну активність, ніж порошок цвіркуна та рибне борошно. Крім того, BSF Post значно збільшив виробництво NO більше, ніж BSF Pre, що свідчить про те, що експелерне пресування може покращити імуногенну здатність BSF. Це може бути пов’язано збагаченням імуногенних молекул або покращеною розчинністю після експелерного пресування. Додаткова обробка може додатково підвищити імуногенну здатність BSF Post. Хоча можна припустити, що прозапальна властивість BSF може зробити високі показники включення менш бажаними, особливо якщо імунна система надмірно стимулюється, хоча сучасна література не свідчить про відсутність порушень у цьому контексті (як описано нижче).

Протизапальна здатність in vitro

Рис. 2: Протизапальна здатність in vitro як гальмування (у відсотках) вироблення оксиду азоту в клітинах RAW264.7. Позначає значні статистичні відмінності порівняно з кверцетином з використанням одностороннього дисперсійного аналізу з подальшим тестом багаторазового порівняння Тьюкі.

Протизапальна здатність (виражена у відсотках пригнічення вироблення NO) показана на рис. 2 і була подібною у відповідь на BSF Pre, BSF Post і зразки рибного борошна. Порівняно з лікуванням клітин кверцетином (протизапальною молекулою рослинного походження), протизапальна здатність була значно нижчою у відповідь на BSF Pre, BSF Post, рибне борошно та порошок цвіркунів. Однак зразки BSF Pre і BSF Post продемонстрували значно вищу протизапальну активність порівняно з порошком цвіркуна.

Нещодавнє дослідження in vivo дослідило вплив додавання BSF у корми для райдужної форелі, виявивши докази зменшення запалення кишечника, особливо при доповненні дієтами на основі сої, які, як відомо, викликають запалення та знижують цілісність кишкового бар’єру. У поточному дослідженні протизапальна здатність була подібною у відповідь на BSF Pre, BSF Post і зразки рибного борошна та значно нижча, ніж клітинна відповідь на кверцетин. Однак зразки BSF Pre і BSF Post продемонстрували значно вищу протизапальну активність порівняно з порошком цвіркуна.

Хімічний склад

Хімічний склад органічного борошна  BSF робить його бажаним інгредієнтом для кормів гідробіонтів і знаходиться в межах діапазону, зазначеного в літературі. Ці продукти багаті білком і містять відносно низький рівень золи та вуглеводів порівняно з іншими альтернативними джерелами білка. Зменшення вмісту ліпідів у борошні з BSF слід розглядати, щоб допомогти досягти кращої поживної цінності для ринку кормів для гідробіонтів (наприклад, рівні ліпідів між 5–12 %  залежно від цільових видів аквакультури). Більш низькі рівні ліпідів у борошні із BSF призведуть до збільшення вмісту білка та вуглеводів і, ймовірно, підвищать імуногенну та протизапальну здатність, як обговорюється нижче.

* Склад зразка надається разом із зразком

Прикінцеві міркування

Органічне борошно з комах BSF містить імуногенні молекули, які були прозапальними та індукували вироблення NO значно більше, ніж рибне борошно та порошок цвіркунів. Примітно, що експелерне пресування значно покращило імуногенну здатність органічного борошна з комах BSF на 60 відсотків. Органічна їжа BSF, здається, підходить як інгредієнт і може мати функціональні властивості, що мають стратегічне значення для кормів гідробіонтів. Оптимізація складу їжі, зокрема шляхом знежирення для збільшення вмісту білка, рекомендується для вдосконалення цього продукту для харчових потреб хижих видів гідробіонтів.

Подальші дослідження in vitro можуть вивчити різні методи обробки та дослідити різні фракції макроелементів, які найкраще підвищують імуногенний потенціал органічного борошна з комах BSF. Дослідження на тваринах також можна розглянути для вивчення потенціалу органічного борошна від комах BSF з різними рівнями включення (функціональна добавка <10 %; джерело білка 10–40 %) для покращення здоров’я кишечника, зменшення тяжкості бактеріальних/вірусних захворювань та використання як комерційно вигідне альтернативне джерело білка.

Посилання на оригінал: Bioactivity of black soldier fly larvae meal