Автор : Dr. Pavlos Makridis
Стаття від : 17 березня 2025
Переклад зроблено фахівцями Державної установи “Методично-технологічний центр з аквакультури”
Дослідження зосереджені на факторах, що впливають на мікробіоту личинок, та підходах до покращення мікробного балансу в системах вирощування.
Дослідження містить огляд наукової літератури, в якій обговорюються мікробні взаємодії між мікробіотою води, мікробіотою живих кормів, імунною системою личинок риб, мікробіотою кишечнику та мікробними спільнотами біоплівки в системах вирощування личинок морських риб. Дослідження фокусується на факторах, що впливають на мікробіоту личинок, та підходах до поліпшення мікробного балансу в системі вирощування для покращення виживання та росту личинок риб. Фото личинок лаврака (Dicentrarchus labrax) , зроблене Olivier Dugornay (CC BY 4.0, https://creativecommons.org/licenses/by/4.0, via Wikimedia Commons).
Протягом останніх десятиліть одним з основних напрямків мікробіології аквакультури було вивчення мікробіоти личинок морських риб. Мікробіота риб має вирішальне значення для здоров’я та розвитку хазяїна, але відносно мало відомо про формування мікробіоти риб протягом перших тижнів після вилуплення. Кишкова мікробіота є важливою перешкодою для колонізації умовно-патогенних мікроорганізмів у кишечнику личинок, в той час як личинки морських риб вразливі до високої смертності протягом перших тижнів після вилуплення, спричиненої розмноженням умовно-патогенних бактерій. Оптимізація умов вирощування, які сприяють розвитку стабільної, різноманітної та стійкої мікробіоти, вимагає визначення факторів, що впливають на мікробну колонізацію.
Бактерії колонізують шкіру, плавники та зябра риби, а деякі дослідження показують, що представники багатьох бактеріальних таксонів колонізують поверхню риби. Бактеріальна колонізація личинок риб є динамічним процесом, на який впливають фактори навколишнього середовища та хазяїна. Детальні дослідження ранньої мікробіоти риб були проведені на декількох культивованих видах, включаючи дораду, жовтохвоста (лакедру), атлантичну тріску, атлантичного лосося, сенегальського морського язика, великого жовтохвоста і гігантського групера, з акцентом на мікробіоту кишечника, оскільки вона має вирішальне значення для поглинання поживних речовин, травлення і загального стану здоров’я риби.
Спочатку бактерії в личинках можуть походити від материнської риби, оскільки мікробіота ікри впливає на мікробіоту личинок і може вплинути на подальший розвиток личинок. Личинки риб п’ють морську воду для осморегуляції, і при цьому вони заковтують мікроорганізми, присутні у воді, тому мікробіота води впливає на мікробіоту риб ще до початку годування. При вирощуванні личинок морських риб використовують живі кормові організми, зокрема коловертки, артемії або копеподи. Мікробні спільноти кишечника личинок риб залежать від типу та бактеріального складу живих кормів. Зоопланктонні кормові організми, мікроводорості та інші личинки постійно взаємодіють один з одним і впливають на мікробіоту личинок.
Ця стаття – реферат оригінальної публікації (Paralika, V. and P. Makridis. 2025. Microbial Interactions in Rearing Systems for Marine Fish Larvae. Microorganisms 2025, 13(3), 539) – огляд наукової літератури, в якому обговорюються взаємодії між мікробіотою води, мікробіотою живих кормів, імунною системою личинок риб та мікробіотою кишечника, а також мікробними спільнотами біоплівки в системах вирощування личинок морських риб. Для отримання детальної інформації про огляд та аналіз літератури зверніться до оригінальної публікації.
Рис. 1: Мікробні взаємодії в системі вирощування личинок морських риб. Живі кормові організми є фільтраторами і, таким чином, впливають на мікробіоту води, і навпаки. На мікробіоту води впливають мікробіота риб, мікроводорості, додані у воду, та біоплівка резервуара, і навпаки. Личинки риб п’ють морську воду і, таким чином, підпадають під вплив мікробіоти води та живого корму, що потрапляє в організм.
Роль мікробіоти личинок риб
Мікробіота личинок риб відіграє вирішальну роль у розвитку та здоров’ї личинок морських риб. Одним з важливих аспектів є внесок мікробіоти в поглинання та перетравлення поживних речовин. Бактеріальна колонізація може покращити стан харчування личинок риб. Члени мікробіоти личинок риб здатні ферментувати складні вуглеводи в раціоні личинок, утворюючи коротколанцюгові жирні кислоти (SCFAs). SCFA можуть слугувати додатковим джерелом енергії для личинок, сприяючи їхньому загальному харчовому статусу та знижуючи рівень рН кишечника, роблячи середовище несприятливим для деяких потенційних патогенів і захищаючи рибу від бактеріальних інфекцій.
Личинки морських риб часто споживають здобич з екзоскелетами, що містять хітин (наприклад, артемії, копеподи та коловертки). Хітин – це складний полісахарид, і кишкові мікроби можуть сприяти перетравленню хітину. Харчовий хітин змінює мікробіоту кишечника риби завдяки своїм пребіотичним, антибактеріальним та імуномодулюючим властивостям, а також збільшує бактеріальне багатство кишечника і кількість корисних бактерій, що розщеплюють хітин. Крім того, члени мікробіоти личинок можуть синтезувати вітаміни, необхідні для росту та розвитку личинок.
Мікробіота личинок риб забезпечує захист від патогенних мікроорганізмів за допомогою різних механізмів, які допомагають підтримувати збалансоване мікробне співтовариство і підтримувати загальний стан здоров’я та життєздатність личинок в умовах вирощування. Першу лінію захисту від патогенів забезпечують бактерії на шкірі личинок та слизовій оболонці їхнього кишечника. Зокрема, ці бактерії конкурують за місця прикріплення та доступні поживні речовини з патогенами, що потрапляють до організму, зменшуючи колонізацію та розмноження цих патогенів і, таким чином, їхню здатність викликати захворювання. Деякі мікроби виробляють антимікробні речовини, такі як бактеріоцини – сполуки, які синтезуються мікроорганізмами для знищення близькоспоріднених видів, або органічні кислоти, що утворюються або в результаті мікробної ферментації вуглеводів різних видів бактерій за різних метаболічних шляхів і умов, або як вторинні метаболіти, які пригнічують ріст або вбивають небажані морські патогени.
Мікробне різноманіття кишечника використовується як біомаркер здоров’я та метаболічної дієздатності риби. Низька різноманітність і нестабільність мікробіоти тісно пов’язані з хворобами риб, оскільки шанси загарбника зайняти нішу в середовищі з високим рівнем різноманітності значно зменшуються, і більш імовірно, що в такому середовищі присутні члени спільноти з антагоністичною активністю. Більше того, численні порушення, включаючи екологічний стрес, можуть спричинити захворювання риб, порушуючи мікробіоту кишечника та підвищуючи вірулентність патогенів.
Контроль бактеріальних інфекцій у системах вирощування личинок може включати управління потенційно шкідливими бактеріями, такими як Vibrio spp. у морській воді системи вирощування. Морська вода слугує спільним середовищем для личинок, живого корму, мікроводоростей та середовища вирощування (включаючи осад, стінки резервуарів, труби тощо), де її мікробіологічна динаміка взаємодіє з динамікою личинок, живого корму та поверхонь навколишнього середовища.
Фактори що впливають на мікробіоту личинок риб
Різні фактори мають велике значення, включаючи вибір хазяїна та стадію розвитку, дієту, мікробіоту води та біоплівки.
Вибір хазяїна та стадія розвитку
Бактеріальна динаміка, пов’язана з ранніми стадіями розвитку личинок риб, є складною і залежить від різних факторів, включаючи навколишнє середовище, вплив батьків, дієту та зміни у розвитку личинок. У міру розвитку личинок риб їхня травна та імунна системи змінюються, що може впливати на динаміку кишково-асоційованих бактеріальних угруповань. Під час розвитку морфологія та функції кишечника змінюються, впливаючи на структуру бактеріальної колонізації, включаючи типи та чисельність бактерій. Бактеріальне різноманіття у личинок риб має тенденцію до поступового збільшення з віком, поки не досягне піку при наближенні до ювенільної стадії.
Зовнішні (дієта, якість води, фізико-хімічні параметри середовища вирощування тощо) та внутрішні (трофічний рівень, генетичний фон, стать, вік тощо) фактори визначають модулювання мікробіоти личинок риб. На ранніх стадіях розвитку личинок мікробне угруповання кишечника формується шляхом видового відбору. Наявність основної мікробіоти у видів риб, вирощених у різних середовищах або за різних умов харчування та часових рядів, вказує на те, що вибір хазяїна є основним фактором, який впливає на мікробний склад.
Дієта
Личинки риб харчуються різними зоопланктонними організмами в дикій природі, в першу чергу копеподами. У системах морської аквакультури традиційний протокол годівлі-вирощування складається з зоопланктону. Виробництво високопоживного живого корму є однією з найважливіших складових успішного вирощування личинок, оскільки воно впливає не лише на ріст личинок, але й на розвиток деформацій, порушення пігментації, а також на загальний стан здоров’я, а отже, і на виживання. Враховуючи, що шлунково-кишковий тракт є одним з основних шляхів проникнення різних патогенних мікроорганізмів, дуже важливо оцінити вплив мікробних угруповань раціону на кишкову мікробіоту риб. Оскільки виробництво живого корму в риборозвіднях стало більш інтенсивним, поширення захворювань стало серйозною проблемою. Широко відомо, що в личинкових культурах живі корми можуть передавати умовно-патогенні та потенційно патогенні бактерії.
Водна мікробіота
Разом з мікробіотою живої їжі та мікроводоростями мікробіота води формує мікробний профіль личинок, що вирощуються. З мікробіологічної точки зору якість води нелегко визначити, оскільки вона характеризується як кількістю, так і якістю присутніх мікробних спільнот. Кількісна частина традиційно знаходиться в центрі уваги, і постійне зниження бактеріального навантаження є основним підходом у морських риборозплідниках. Однак більш важливими є якісні характеристики водної мікробіоти, які, тим не менш, важко оцінити, за винятком наявності або відсутності добре відомих патогенних мікроорганізмів.
Теорія, яка може бути використана для визначення мікробної якості води, базується на стратегії r/K; бактерії розподіляються на дві функціональні групи, r- та K-селективні бактерії, відповідно. К-стратеги ростуть повільніше, знаходяться в щільних зонах з підвищеною конкуренцією за ресурси і мають тенденцію до створення більш стабільних спільнот. Мікроорганізми, що дотримуються r-стратегії, зустрічаються в протилежному спектрі цих умов, і опортуністичні патогени часто дотримуються цього режиму. Цей підхід був застосований для оцінки та управління мікробним середовищем при вирощуванні личинок, і виявилося, що опортуністичні види здебільшого відповідальні за паразитарні взаємодії між хазяїном і мікробами. Вигідно створити стабільну мікробну спільноту в системі вирощування, в якій домінують К-стратеги, в той час як опортуністичні стратеги отримають вигоду від використання антимікробних засобів та дезінфекції, що створить нові ніші.
Біоплівки
Після того, як тверда поверхня вперше потрапляє в морську воду, розчинені органічні речовини прилипають до неї і за лічені секунди створюють тонку плівку (<100 нанометрів), відому як “молекулярне обростання”. На склад і структуру біоплівкових мікробних спільнот впливають численні фактори, такі як відмінності в нішах, зміни якості води, доступність неорганічних поживних речовин і органічних ресурсів для організмів, глибина води і вік біоплівки, властивості поверхні субстрату і температурна ситуація. Колонізація твердих поверхонь і утворення біоплівок є вигідним для деяких бактерій, оскільки біоплівки протистоять висиханню, покращують стійкість до антибіотиків, мають вищу концентрацію поживних речовин і демонструють кращий захист від хижаків.
В аквакультурних системах вирощування бактеріальні біоплівки можуть містити умовно-патогенні бактерії та слугувати резервуаром для тих мікробів, які можуть колонізувати товщу води, що може зробити їх постійним джерелом бактеріальної інфекції для видів, що вирощуються. Бактерії в біоплівці корисні для переробки поживних речовин і усунення небажаних з системи, зменшення токсичного неорганічного азоту через нітрифікацію і гетеротрофні бактерії, а також для покращення росту і виживання риби і креветок.
Методи що використовуються для дослідження мікробіоти личинок риб
Вивчення мікробних угруповань у рибі може базуватися на культурально-залежних або культурально-незалежних методах. Культурально залежні методи дозволяють ідентифікувати бактерії до видового рівня, і одним з основних наслідків цього є те, що культурально залежні методи можуть підтвердити результати незалежних від культури підходів, підтверджуючи наявність конкретних мікроорганізмів і надаючи ізоляти для подальшого вивчення, наприклад, для виділення та ідентифікації бактерій, які були охарактеризовані як потенційні пробіотики.
Дослідження мікробіоти личинок риб зосереджені на поясненні фундаментальних процесів функціонування з метою розробки інноваційних підходів до управління мікробними популяціями. Для цього необхідно ідентифікувати та охарактеризувати мікробні спільноти в різних частинах систем вирощування. Величезну кількість мікробів у цих системах можна виявити лише за допомогою нових молекулярних інструментів, які називаються культурально-незалежними методами і передбачають безпосереднє виділення ДНК або РНК із зразка без необхідності культивування мікробів. (Таблиця 1).
| Метод | Опис методу |
| Біохімічні тести | Бактерії можуть мати варіабельну або слабку реакцію, що призводить до помилкової ідентифікації. Важко розрізнити близькоспоріднені види зі схожими метаболічними профілями. |
| Культурально залежні методи (класична мікробіологія) | Багато бактерій не культивуються. Ідентифікація на основі морфології клітин або фізіологічних тестів вимагає багато часу і праці, і часто неможливо ідентифікувати ізоляти на видовому рівні. |
| Проточна цитофлуориметрія та флуоресцентна гібридизація in situ (FISH) | Потребує специфічних зразків для відомих бактерій. Менш ефективний для виявлення рідкісних або невідомих таксонів. Трудомісткий і вимагає дорогого обладнання. |
| Метагеноміка та секвенування методом “постріл рушницею” | Висока вартість і вимагає досвіду в біоінформатиці. Коротке зчитування секвенування може призвести до помилок при складанні. Забруднення може ввести в оману таксономічну класифікацію. |
| Ідентифікація на основі ПЛР (секвенування 16S рРНК, мультиплексна ПЛР) | Послідовності 16S рРНК можуть не диференціювати близькоспоріднені види. Інгібітори ПЛР із зразків навколишнього середовища можуть впливати на результати. Потребує специфічних праймерів, які можуть не охоплювати всі бактеріальні таксони. |
Таблиця 1: Методи дослідження мікробіомів риб та їх характеристики.
Секвенування наступного покоління (NGS) було представлено на початку 21-го століття. NGS зробило величезний крок вперед, дозволивши швидко та економічно ефективно створювати величезні обсяги даних, з вищою точністю секвенування ДНК порівняно з попередніми методами. На даний момент всі підходи NGS вимагають підготовки бібліотеки. Вони широко використовуються для профілювання мікробних спільнот у зразках навколишнього середовища, включаючи личинки риб, а також для вивчення мікробного різноманіття, структури спільнот і функціонального потенціалу. Крім того, вони дають комплексне уявлення про мікробне різноманіття, включаючи некультивовані та рідкісні мікроорганізми. Підходи NGS уможливлюють високопродуктивний аналіз мікробних спільнот, дозволяючи одночасно профілювати декілька зразків.
Перспективи
Вивчення мікробних взаємодій у системах вирощування личинок зосереджено на факторах, що впливають на мікробіоту личинок, можливих підходах до покращення мікробного балансу в системах вирощування личинок, а також на використанні пробіотиків у вирощуванні личинок для покращення виживання та росту личинок. Раніше ці підходи та їх вплив на мікробіоту води, риби та живих кормів відстежували за допомогою класичної мікробіології, що було дуже трудомістким і вкрай неефективним процесом. Тепер, із застосуванням молекулярних методів, буде легше отримати більш чіткі відповіді на ті ж самі питання. Крім того, з появою нових живих кормових організмів, таких як личинки вусоногих раків або легкодоступні копеподи, вплив на мікробіоту личинок риб можна буде оцінювати набагато надійніше.
