Автор: Prof C Greg Lutz : Professor and extension specialist at Louisiana State University Agricultural Center
Кріоконсервація, що включає заморожування та зберігання яйцеклітин і сперми при наднизькій температурі, була продемонстрована з різним ступенем успіху для низки видів гідробіонтів, що вирощуються, але для забезпечення стабільної та ефективної роботи потрібні більш стандартизовані методи.
Набір інструментів для кріоконсервації. Кріоконсервація передбачає збір дозрілих гамет (статтевих клітин) із маточного поголів’я та їх приготування/підготовку в розчині, який нагадує їхнє звичайне внутрішнє середовище, а потім їх зберігання при дуже низьких температурах© AGGRC
Методи кріоконсервації ще не застосовувалися в комерційних масштабах для жодного з основних товарних видів, таких як сьомга, тиляпія, сом або коропи, але це може змінитися в найближчі роки. Кріоконсервовані гамети, ймовірно, матимуть більш практичне застосування в інкубаційних установках, де вже використовується штучне запліднення, як це було б у випадку деяких лососевих, гібридного смугастого окуня, гібридного сома та осетрових, і це лише деякі з них.
Що таке кріоконсервація? Деякі з наданих тут описів містять спрощення або, можливо, надмірне спрощення, але це часто необхідний підхід для охоплення цього методу.
Типова методологія в умовах аквакультури передбачає збір дозрілих гамет (статевих клітин) від особин з племінного поголів’я та підготовку їх у розчині, який нагадує їхнє звичайне внутрішнє середовище з точки зору осмолярності, рН та інших характеристик. Потім до розчину додають різні сполуки, щоб зменшити шкідливий вплив заморожування та розморожування. Зразки охолоджують до дуже низьких температур, а потім зберігають при ще більш низьких температурах, щоб зупинити всі клітинні метаболічні процеси (зазвичай у рідкому азоті при -196°C). Коли все піде правильно, зразки будуть біологічно життєздатними після розморожування.
Касета для заморожування під час кріоконсервації. Ця система дозволяє заморожувати яйцеклітини та зразки тканин, а потім завантажувати їх у пластикові трубочки для кріоконсервації. Зменшує обсяги маніпуляцій зі зразком і дозволяє тестувати різні методи заморожування © AGGRC
Навіщо це робити? – Використання кріоконсервованих гамет може призвести до кращої синхронізації відтворення в умовах інкубаційного цеху, більш ефективного використання сперми (як з точки зору кількості потомства, так і щодо підтримки генетичної варіації) і легшого поширення зародкової плазми для програм селекції та збереження.
Успішну кріоконсервацію сперми було зроблено для багатьох видів риб (деякі звіти свідчать про понад 200), але лише обмежений успіх був зареєстрований у ікри або зигот. Сперма, як правило, ліпше піддається методам кріоконсервації через кілька властивих їй характеристик: проникність клітинної мембрани, загальний малий об’єм клітини та просту структуру без більшості внутрішніх органел. Тим не менш, сперма риби покладається на крихку структуру, що називається джгутиком, щоб забезпечити пересування, якого можна легко пошкодити в процесі.
За останні роки кілька лабораторій повідомили про успіх у заморожуванні та оживленні ооцитів і навіть ембріонів риб, але комбінація факторів обмежила використання цього підходу. До таких факторів належить можливість активації ікринки при зануренні в різні рідини, непроникність хоріуму ікринки з результуючою тенденцією до утворення внутрішньоклітинного льоду під час заморожування та наявність великої кількості жовткового матеріалу. Тим не менш, в цій галузі досліджень кріоконсервації досягається певний прогрес (Li et al. 2022).
Кріоконсервація сперми також широко застосовувалася до низки видів молюсків, зокрема успішне кріоконсервування та розморожування личинок, що розвиваються, було продемонстровано для деяких видів двостулкових молюсків (Yang & Huo, 2022). На жаль, механізми відтворення ракоподібних ускладнюють застосування кріоконсервації цих видів.
Інжектор Cajun для кріоконсервації. Моторизований інжектор Cajun з контролером і датчиком для визначення положення зразків (у трубочках) © AGGRC
Більшість промислово важливих десятиногих (декапод) використовують структурно складні сперматофори, які передаються від самця до самиці, з окремими нерухомими сперматозоїдами, які згодом вивільняються під час відкладання яєць. Це ускладнює рівномірне швидке заморожування. Хоча повідомлялося про успіх у кріоконсервації сперматофорів Penaeus vannamei (Paniagua-Chavez & Morales-Ueno 2019), інші декаподи виявились більш проблематичними. Aquino et al. (2021) зробили вичерпний огляд сучасного стану кріоконсервації промислово важливих ракоподібних.
Методологія кріоконсервації
Фактична методологія, яка використовується для кріоконсервації водних видів, диявольськи складна. При кріоконсервації клітин відбувається кілька процесів одночасно. Вода всередині клітин може почати замерзати та утворювати шкідливі кристали льоду, особливо при високих швидкостях охолодження. При меншій швидкості охолодження вода в розчині, що оточує сперму, може почати утворювати кристали льоду, що з часом призводить до більш концентрованої рідини. Це має тенденцію витягувати воду через мембрани клітин, зрештою зневоднюючи їх. На щастя, існує низка хімічних речовин, які можна використовувати для зменшення або запобігання шкідливому впливу цих процесів. Разом вони називаються кріопротекторами (CPA). Цей підхід вперше було використано, коли Polge et al. (1949) показали, що додавання гліцерину дозволяє виживати спермі птахів при заморожуванні та розморожуванні.
Інжектор Cajun для кріоконсервації. Моторизований інжектор Cajun з контролером і датчиком для визначення положення зразків (у трубочках) © AGGRC
Для водних видів зазвичай використовуються два типи кріопротекторів: проникні та непроникні. Проникні CPA можуть перетинати клітинні мембрани, щоб зменшити внутрішній ріст кристалів льоду, зменшити втрату води з клітини та/або допомогти стабілізувати концентрацію солі. Приклади включають ДМСО (диметилсульфоксид), метанол, пропіленгліколь і гліцерин. На жаль, ці сполуки часто токсичні у високих концентраціях. Це змушує знайти компроміс між захистом і токсичністю.
Непроникні засоби захисту функціонують у позаклітинному середовищі. Приклади включають різні цукри та полімери. Деякі протоколи як непроникні CPA включають сироватку яєчного жовтка, знежирене молоко і навіть антифризні білки. Вони знижують температуру замерзання розчину та можуть мінімізувати вплив осмотичного пошкодження та холодового шоку.
Активація сперми може бути проблемою під час заморожування або розморожування. Для більшості прісноводних риб активація ініціюється зниженням осмотичного тиску, тоді як підвищення осмотичного тиску запускає процес для більшості морських видів. Це ускладнює процеси заморожування та відтавання, відповідно, оскільки накопичення зовнішніх іонів у розчині (у міру утворення льоду) потенційно може активувати сперму морських видів, а зменшення іонів через танення льоду під час відтавання може мати подібний ефект для сперматозоїдів прісноводних видів риб. Фізичне пошкодження також може виникнути в сперматозоїдах, особливо в середній частині (органели живлення) і джгутику (рушія). Обидва типи пошкодження можуть значно зменшити рухливість, що призводить до низького рівня запліднення.
Зважаючи на таку кількість факторів, зрозуміло, що кожен вид пред’являє різні вимоги до оптимальних кріопротекторів, а також до швидкості як зниження температури, так і подальшого розморожування. Вони повинні бути встановлені методом проб і помилок.
У спільноті дослідників практично не було стандартизовано методів чи обладнання, і в деяких випадках для одного виду використовувалося багато різних протоколів із різними результатами. Різниця в розріджувачах, кріопротекторах, моделях заморожування та розморожування та якості сперми – усе це посилює труднощі у створенні та повторенні результатів досліджень. І, окрім відмінностей у лабораторній методології, різні популяції можуть демонструвати різну якість сперми внаслідок умов навколишнього середовища. Зрештою, важко зрозуміти, чи спрацював протокол кріоконсервації, без певної оцінки якості сперми перед заморожуванням – але знову ж таки, ці процедури не стандартизовані.
Інструменти для роботи/досліджень
Дослідники, які працюють за цим напрямом досліджень, зазвичай змушені використовувати дороге обладнання, розроблене для наземних тварин, а не для водних видів, таке як керовані комп’ютером програмовані морозильні камери, проточні цитометри, трубочки для заморожування сперми худоби та інші інструменти. І навпаки, ті, хто не має доступу до таких ресурсів, змушені імпровізувати з порівняно нескладними матеріалами.
Інжектор Cajun. Цей пристрій дозволяє здійснювати рівномірне заморожування (кріопротектор і відносно повільне заморожування) генетичного матеріалу з контрольованою швидкістю для отримання стандартизованих зразків, придатних для зберігання матеріалу у сховищах. Це корисно для кріоконсервації в польових умовах або в лабораторіях, які обробляють недостатньо багато зразків, щоб виправдати ціну інструментів в десятки тисяч доларів. Вартість ручного приладу нижче 10 доларів. Також доступний моторизований пристрій. © AGGRC
Одним із поширених прикладів є метод охолодження парою, коли зразки підвішуються в парі над резервуаром рідкого азоту. Оптимальні криві охолодження базуються на комбінаціях висоти/часу перебування в парі. Це не тільки передбачає підхід проб і помилок, але також часто неможливо стандартизувати та відтворити результати через різні фактори, такі як обсяг рідкого азоту, розташування зразка, плавучість контейнера для зразка після розміщення в рідині, розміри та товщина контейнера та нескінченні інші міркування.
До цього часу більшість опублікованих робіт щодо кріоконсервації гідробіонтів відображали численні інтелектуальні та біологічні вправи/екзерсиси з окремими ізольованими протоколами та мало можливостей для відтворюваності результатів чи стандартизації. Але все це змінюється. Багато дисциплінарна група інженерів, біологів і виробників застосовує – за відсутності доступного обладнання та інструментів, які можна налаштувати, – новий спосіб вирішення проблеми за рахунок одночасного покращення стандартизації процедур. Концепція відкритих технологій обіцяє створити спільноту розробників, виробників і користувачів інструментів, програмного забезпечення та обладнання, спеціально зосереджених на розвитку науки про кріоконсервацію гідробіонтів.
Команда дослідників Центру зародкової плазми та генетичних ресурсів гідробіонтів AgCenter (AGGRC) Університету штату Луїзіана розпочала використання підходу ”відкритого апаратного забезпечення”, який включає доступні технології, такі як 3-D друк, мікропроцесори, електронні периферійні компоненти з відкритим доступом, підключення до Інтернету та програмне забезпечення для проєктування з відкритою ліцензією для розробки спеціалізованих інструментів для вирішення проблем, з якими стикаються дослідники кріоконсервації, які працюють з гідробіонтами (Liu та ін. 2021). Особливо тих, хто працює з обмеженим бюджетом. У міру того, як спільнота користувачів розширюється, можливості поширення, спільного використання, модифікації та вдосконалення цих інструментів кріоконсервації також будуть розширюватися. Така спільнота також може сприяти спільному сукупному/аґреґованому розвитку сховищ зародкової плазми.
Кріонабір. Цей пристрій зменшує витрати на заморожування генетичного матеріалу з контрольованою швидкістю. Отримані зразки можна зберігати в судині Дьюара. Розташування морозильної платформи (темно-синього кольору) від основи рами визначає швидкість заморожування. Пристрій використовується як такий що плаває у рідкому азоті в пінопластовому боксі. © AGGRC
Забезпечення доступу
Ключем до стратегії відкритих технологій є доступ, який, у свою чергу, дозволяє спільноті співпрацювати. Необхідні канали доступу вже використовуються більшістю з нас щодня у формі веб-сайтів, спільних серверів, онлайн-відео та програм для обміну даними. Деякі приклади відкритих платформ, які вже використовуються дослідниками аквакультури, включають Міжнародну базу даних кормів для аквакультури (Aquaculture Feed Formulation Database) та GenBank. Завдяки налагодженню каналів співпраці програмне забезпечення для автоматизованого проєктування та виробництва з відкритою ліцензією можна використовувати будь-де за допомогою 3-D-принтерів, компактних млинів із комп’ютерним керуванням і 3-D-сканерів для виробництва компонентів для будь-яких потреб внутрішнього обладнання.
Одним із прикладів, розробленим командою AGGRC, є транспортований позиційний охолоджуючий пристрій Дьюара (SDPCD) для заморожування та зберігання зразків. За ціною приблизно 8 доларів пристрій включає вісім 3-D надрукованих компонентів і комерційно доступну металеву пружину. SDPCD дозволяє стандартизовану швидкість охолодження в діапазоні від 1 до 68 °C на хвилину, що дозволяє дослідникам у різних місцях краще гармонізувати свою методологію охолодження. Інші пристрої були розроблені командою для забезпечення стандартизації швидкості охолодження при використанні полістирольних ящиків для зберігання рідкого азоту.
AGGRC співпрацює з іншими установами, щоб підвищити інтерес до розробки та виготовлення пристроїв для збереження генетичних ресурсів. Пристрій виготовлено студентами-механіками Бостонського університету під керівництвом дослідників AGGRC. © AGGRC
Іншою цікавою концепцією, розробленою AGGRC, є конвеєрний пристрій із керованим охолодженням (CCCD), який переміщує зразки через охолоджувальне пароподібне середовище та автоматично опускає їх у рідкий азот після досягнення відповідної температури. Недорогі компоненти можна навіть налаштувати для моніторингу температури в трубочках для заморожування.
Поточна співпраця в AGGRC і за його межами ілюструє можливості, інструменти та ресурси, які доступні навколо нас – не лише для кріоконсервації, але й для багатьох інших аспектів досліджень аквакультури. Коли дослідники та кінцеві користувачі працюють разом як спільнота, можливості можуть бути безмежними.
Посилання
